Metodi di sequenza dNA

Il campo della biotecnologia è un cambiamento costante. La rapida crescita e sviluppo della ricerca all'avanguardia dipendono dall'innovazione e dalla creatività degli scienziati e dalla loro capacità di vedere il potenziale in una tecnica molecolare di base e di applicarla a nuovi processi. L'avvento della PCR ha aperto molte porte nella ricerca genetica, incluso un mezzo di analisi del DNA e identificazione di diversi geni basati sulle loro sequenze di DNA.

Il sequenziamento del DNA dipende anche dalla nostra capacità di utilizzare l'elettroforesi del gel per separare i fili del DNA che differiscono per dimensione per una quantità minima di una coppia di base.

Sequencing del DNA

Alla fine degli anni 70, furono inventate due tecniche di sequenziamento del DNA per molecole di DNA più lunghe. Questi erano il metodo

Sanger (o dideossido) e il metodo Maxam-Gilbert . Il metodo Maxam-Gilbert è basato sulla scissione specifica dei nucleotidi da parte delle sostanze chimiche ed è meglio utilizzata per sequenziare oligonucleotidi (polimeri brevi nucleotidi, di solito inferiori a 50 coppie di base in lunghezza). Il metodo Sanger è più comunemente usato perché è stato dimostrato tecnicamente più facile da applicare e, con l'avvento della PCR e l'automazione della tecnica, è facilmente applicabile a lunghe fili di DNA compresi interi geni. Questa tecnica è basata sulla terminazione di catene da dideossinucleotidi durante le reazioni di allargamento PCR. Metodo Sanger

Nel metodo Sanger, il filo DNA da analizzare viene utilizzato come template e la polimerasi di DNA viene usata, in una reazione PCR, per generare filamenti complementari utilizzando primer.

Sono state preparate quattro miscele di reazione PCR, ciascuna contenente una certa percentuale di analoghi di dideossinucleosid trifosfato (ddNTP) a uno dei quattro nucleotidi (ATP, CTP, GTP o TTP). La sintesi del nuovo filamento di DNA continua finché uno di questi analoghi non viene incorporato, al momento in cui il filo è troncato prematuramente.

Ogni reazione PCR finirà con una miscela di diverse lunghezze di fili di DNA, tutti terminanti con il nucleotide che era dideossico etichettato per quella reazione. L'elettroforesi del gel viene quindi utilizzato per separare i fili delle quattro reazioni, in quattro corsie separate e determinare la sequenza del modello originale in base a quali lunghezze di fili si concludono con quello nucleotidico.

Nella reazione automatizzata di Sanger, vengono utilizzati primer etichettati con quattro differenti tag fluorescenti colorati. Le reazioni PCR, in presenza dei differenti nucleosidi dideossici, vengono eseguiti come sopra descritto. Tuttavia, successivamente, le quattro miscele di reazione vengono poi combinate e applicate ad una singola corsia di un gel. Il colore di ogni frammento viene rilevato utilizzando un fascio laser e le informazioni vengono raccolte da un computer che genera cromatogrammi che presentano picchi per ogni colore, da cui è possibile determinare la sequenza di DNA del template.

In genere, il metodo di sequenziamento automatizzato è solo preciso per sequenze fino ad un massimo di circa 700-800 coppie di base in lunghezza. Tuttavia, è possibile ottenere sequenze complete di geni più grandi e, infatti, interi genomi, utilizzando metodi step-wise come il sequenziamento di Primer Walking e Shotgun.

In

Primer Walking

, una porzione operabile di un gene più grande viene sequenziata utilizzando il metodo Sanger. Nuovi primer vengono generati da un segmento affidabile della sequenza e utilizzati per continuare a sequenziare la porzione del gene che era fuori campo delle reazioni originali.

La sequenza di sequenze comporta la taglio casuale del segmento di interesse di DNA in frammenti di dimensioni più appropriate (gestibili), sequenziando ogni frammento e sistemando i pezzi basati su sequenze sovrapposte. Questa tecnica è stata resa più agevole grazie all'applicazione di software per l'organizzazione dei pezzi sovrapposti.